真蛋白是怎么定義的？怎么測(cè)定？

夏唯沫 · 發(fā)表于 2011-5-30 22:05:29

真蛋白是怎么定義的？怎么測(cè)定？

胖豬豬 · 發(fā)表于 2011-5-30 22:59:57

查查飼料工業(yè)匯編

小曉 · 發(fā)表于 2011-5-31 09:44:55

真蛋白是生物學(xué)上的概念，是相對(duì)與粗蛋白而言的
1、粗蛋白質(zhì)是含氮物質(zhì)的總稱。
2、真蛋白指純蛋白質(zhì)。
3、粗蛋白質(zhì)包括真蛋白質(zhì)和含氮物(氨化物)。
4、測(cè)定方法：粗蛋白質(zhì)的測(cè)定以測(cè)總含氮量為定。
真蛋白質(zhì)的測(cè)定以測(cè)總蛋白質(zhì)含量為定。

百森 · 發(fā)表于 2011-5-31 10:46:51

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1 適用范圍

本操作方法適用配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

2 原理

樣品在水溶液中，加入過(guò)量硫酸銅，在堿性條件下，純蛋白被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的測(cè)定方法測(cè)定其含氮量。

3 試劑

3.1 10%硫酸銅溶液：

稱取五水硫酸銅10g用水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容至刻度。

3.2 2.5%氫氧化鈉溶液：

稱取2.5g氫氧化鈉用水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容至刻度。

3.3 硫酸：化學(xué)純，含量為98%，無(wú)氮。

3.4 催化劑：0.4g硫酸銅，5個(gè)結(jié)晶水，6g硫酸鈉，均為化學(xué)純，磨碎混勻。

3.5 氫氧化鈉：化學(xué)純，40%水溶液（M/V）。

3.5.1
配制方法：

500g氫氧化鈉+1100ml蒸餾水。

3.6 硼酸：化學(xué)純，2%水溶液（M/V）。

3.6.1
配制方法：

20.5g硼酸+1000ml蒸餾水。

3.7 混合指示劑：

甲基紅，1%乙醇溶液，溴甲酚綠，0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個(gè)月。

3.7.1
溴甲酚綠，0.5%乙醇溶液配置：

溴甲酚綠0.125g+25ml乙醇。

3.7.2
甲基紅，1%乙醇溶液配置：

甲基紅0.025g+25ml乙醇。

3.8 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定，按GB/T601制備。

3.8.1 0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.67ml鹽酸，分析純，注入1000ml蒸餾水中。

3.8.2 0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：8.3ml鹽酸，分析純，注入1000ml蒸餾水中。

3.9 硫酸銨：分析純，干燥。

3.10 蔗糖：分析純。

4 儀器設(shè)備

4.1 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)。

4.2 分樣篩：孔徑0.45mm（40目）。

4.3 分析天平：感量0.0001g。

4.4 電爐。

4.5 滴定管：酸式，25、50ml。

4.6 凱氏燒瓶： 250ml。

4.7 凱氏蒸餾裝置：常量直接蒸餾式或半微量水蒸汽蒸餾式。

4.8 錐形瓶：250ml。

4.9 容量瓶：100ml。

4.10 燒杯：200ml。

4.11 干燥箱。

5 分析步驟

5.1 半微量法

5.1.1樣品的處理

稱取待測(cè)樣品0.5-1g（精確到0.1mg）于200ml（4.10）燒杯中，加入50ml蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，在電爐（4.4）上加熱煮沸，加入20ml 10%硫酸銅溶液（3.1），再加入20ml 2.5%氫氧化鈉溶液（3.2）攪勻，從電爐上取下，在室溫放置2h，然后用傾瀉法將樣品過(guò)濾到濾紙上，用少量溫水多次洗滌燒杯和沉淀物，直至洗出液無(wú)硫酸根離子（用10%氯化鋇溶液來(lái)檢驗(yàn)濾液無(wú)沉淀），連同漏斗一起放入80℃干燥箱（4.11）中烘干，將濾紙和沉淀物小心放入250ml凱氏燒瓶（4.6）中，加入6.4g 催化劑（3.4），20ml 濃硫酸（3.3），在電爐（4.4）上消化，樣液澄清后繼續(xù)消煮2h，取下冷卻后加入20ml蒸餾水，轉(zhuǎn)入100ml 容量瓶（4.9）中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

5.1.2
蒸餾

將半微量蒸餾裝置（4.7）的冷凝管末端浸入裝有20ml 硼酸（3.6）的吸收液和2滴混合指示劑（3.7）的錐形瓶（4.8）內(nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過(guò)程中保持此液為橙紅色，否則需補(bǔ)加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10-20ml 注入蒸餾裝置中，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，同時(shí)用蒸餾水沖洗蒸餾裝置入口內(nèi)壁使樣品分析液和沖洗液一并流入反應(yīng)室，迅速將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min 降下錐形瓶使冷凝管末端離開(kāi)液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。

5.1.3
滴定

蒸餾后的吸收液立即用0.02 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.1）滴定，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。

5.2 常量法

5..2.1 稱取待測(cè)樣品0.5-1g（精確到0.1mg）于200ml（4.10）燒杯中，加50ml蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，在電爐（4.4）上加熱煮沸，加入20ml10%硫酸銅溶液（3.1），再加入20ml2.5%氫氧化鈉溶液（3.2）攪勻，從電爐上取下，在室溫放置2h，然后用傾瀉法將樣品過(guò)濾到濾紙上，用少量溫水多次滌燒杯和沉淀物，直至洗出液無(wú)硫酸根離子（10%氯化鋇溶液來(lái)檢驗(yàn)濾液無(wú)沉淀），連同漏斗一起放入80℃干燥箱內(nèi)烘干，將濾液和沉淀物小心放入250ml凱氏燒瓶（4.6）中，加入6.4g催化劑（3.4），20ml濃硫酸（3.3），在電爐上消化，樣液澄清后繼續(xù)消煮2h，取下放冷后加入60-100ml蒸餾水，搖勻冷卻。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

5.2.2
將蒸餾裝置（4.7）的冷凝管末浸入裝有25ml硼酸（3.6）吸收液和2滴混合指示劑（3.7）的錐形瓶?jī)?nèi)。然后小心的向凱氏燒瓶（4.6）中加入50ml氫氧化鈉溶液，輕輕搖動(dòng)凱氏燒瓶，使溶液混勻后再加熱蒸餾，直至流出液為100ml，降下錐形瓶，使冷凝管末端離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1-2min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。

5.2.3
滴定

蒸餾后的吸收液立即用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.2）滴定，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。

5.3蒸餾步驟的檢驗(yàn)

精確稱取0.2g硫酸銨（3.9）代替試樣，按5.1或5.2步驟進(jìn)行操作，測(cè)得硫酸銨含氮量為21.19±0.2%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

5.4空白測(cè)定

稱取蔗糖（3.10）0.5g，代替試樣，按5.1或5.2步驟進(jìn)行空白測(cè)定，消耗0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.2）的體積不得超過(guò)0.2ml。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.1）體積不得超過(guò)0.3ml。

6 分析結(jié)果的表述

6.1計(jì)算見(jiàn)下式：

真蛋白（%）=	(V1-V2)×C×0.0140×6.25	×100
	m×V′/V

式中：V1—滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；

V2—滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；

C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V—試樣分解液的總體積，ml；

V′—試樣分解液蒸餾用體積，ml；

0.0140—每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；

6.25—氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

6.2 重復(fù)性

每個(gè)試樣取兩個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為結(jié)果。

當(dāng)真蛋白含量在25%以上時(shí)，允許相對(duì)偏差為1%。

當(dāng)真蛋白含量在10%—25%之間時(shí)，允許相對(duì)偏差為2%。

當(dāng)真蛋白含量在10%以下時(shí)，允許相對(duì)偏差為3%。

7 關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)

7.1 傾瀉法過(guò)濾洗滌時(shí)，燒杯中的沉淀物一定要徹底清洗。室溫較低時(shí)洗滌用水的溫度要稍微高一點(diǎn)，以保證燒杯中的沉淀物徹底轉(zhuǎn)移。

7.2 過(guò)濾時(shí)的濾液達(dá)到400ml后再用10%的氯化鋇溶液檢驗(yàn)濾液是否有沉淀，這樣可以減少檢驗(yàn)次數(shù)。

7.3烘干沉淀時(shí)，可將濾液倒掉，將漏斗和盛放濾液的容器同時(shí)放入干燥箱，以免漏斗放置不穩(wěn)沉淀物遺失。

7.4加入混合催化劑在電爐上消化時(shí)，要時(shí)刻觀察樣液的顏色變化（有些單一飼料中含雜質(zhì)較多不易觀察顏色），樣液徹底澄清后再計(jì)時(shí)繼續(xù)消煮2h。

7.5半微量法測(cè)定真蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)要遵循少量多次的原則，一方面轉(zhuǎn)移的溶液體積不超過(guò)100ml ，也要做到轉(zhuǎn)移徹底。

8 檢測(cè)結(jié)果比較：

棉柏1真蛋白——42.31%，粗蛋白——42.91%；

DDG真蛋白——31.10%，粗蛋白——31.56%；

肉松粉真蛋白——78.89%，粗蛋白——79.15%；

豆柏真蛋白——46.28%，粗蛋白——46.68%；

豬濃縮料真蛋白——39.98%，粗蛋白——41.03%；

豬配合料真蛋白——16.39%，粗蛋白——16.66%；

以上為合格產(chǎn)品真蛋白比粗蛋白含量稍微有點(diǎn)低，但不會(huì)低太多，看下面的一組不合格產(chǎn)品的比較：

棉柏2真蛋白——37.30%，粗蛋白——40.51%；

DDG真蛋白——34.56%，粗蛋白——37.88%；

肉松粉真蛋白——75.15%，粗蛋白——79.85%；

豬濃縮料真蛋白——36.59%，粗蛋白——40.69%；

豬配合料真蛋白——16.39%，粗蛋白——19.37%；

這些數(shù)據(jù)相差較大，如果只檢驗(yàn)粗蛋白不能夠表明飼料的可利用價(jià)值，所以一旦在使用過(guò)程中效果不好，也可以考慮檢驗(yàn)真蛋白是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)對(duì)飼料中真蛋白質(zhì)和粗蛋白質(zhì)測(cè)定，可以發(fā)現(xiàn)飼料產(chǎn)品標(biāo)示成分的差異，飼料生產(chǎn)企業(yè)在采購(gòu)原料時(shí)，對(duì)飼料中真蛋白質(zhì)的測(cè)定，應(yīng)做為配制飼料的依據(jù)；同時(shí)，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)戶來(lái)說(shuō)，認(rèn)清差別，對(duì)提高養(yǎng)殖效益有著較好的意義。