PRRSV感染豬體內(nèi)多殺性巴氏桿菌的分離與血清型鑒定

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   陳申秒，李 郁，謝玉潔，王桂軍，魏建忠

   自2006年入夏以來(lái)，我國(guó)南方地區(qū)許多豬場(chǎng)發(fā)生了以高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征的流行性疾病—豬“高熱病”，具有高發(fā)病率和高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為弄清其病因，各地相關(guān)學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量的研究，最后證實(shí)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)變異株是本次豬高熱病的主要病原。PRRSV感染能?chē)?yán)重?fù)p害機(jī)體的免疫器官，造成免疫抑制，從而繼發(fā)其他傳染病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV單獨(dú)感染引起的病理變化多為間質(zhì)性肺炎，然而，發(fā)生高熱病的豬表現(xiàn)的病變情況則較為復(fù)雜和嚴(yán)重，表明PRRSV與其他病原體(如豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等)的繼發(fā)和混合感染是引致豬“高熱病”發(fā)生的原因所在。
安徽省許多地方也同期發(fā)生了疫情較為嚴(yán)重的豬“高熱病”，為研究和分析病豬由PRRSV引起的的繼發(fā)或混合感染情況，本試驗(yàn)應(yīng)用常規(guī)方法和PCR技術(shù)從安徽省多個(gè)豬場(chǎng)PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性的病料中進(jìn)行多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)的分離鑒定，并確定其血清型，從而為安徽省豬“高熱病”的綜合防控提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
1材料與方法
1．1試驗(yàn)材料
1．1．1病料
采集安徽肥西、廬江、肥東、定遠(yuǎn)、桐城五個(gè)地區(qū)(代號(hào)為FX、LJ、FD、DY、TC)豬場(chǎng)病料(肺臟)共計(jì)49份，經(jīng)RT．PCR，PRRSV檢測(cè)均為陽(yáng)性。
1．1．2參考菌株
多殺性巴氏桿菌(A型)由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物所。
1．1．3主要試劑
5％胎牛血清肉湯、普通瓊脂、鮮血瓊脂等培養(yǎng)基自制；葡萄糖等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管以及靛基質(zhì)、硝酸鹽還原試劑盒均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP、DL2000DNA Marker等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。
1．1．4 引物
根據(jù)Townsend等報(bào)道合成Pm種與型特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

1．2細(xì)菌分離培養(yǎng)
無(wú)菌采取病料，接種于5％胎牛血清肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)l8～24 h后，分別轉(zhuǎn)種到普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落染色、鏡檢。
1．3生化試驗(yàn)
將分離菌純化后，接種于上述各種生化培養(yǎng)基中(用前加入5％胎牛血清、0．01％NAD)，37℃培養(yǎng)24～48 h。
1．4細(xì)菌DNA模板的制備
將分離純化菌接種到5％胎牛血清肉湯中，37℃、l00 r／min振蕩培養(yǎng)24 h，取5μL菌液直接作為DNA模板。
1．5 Pm種和型的PCR鑒定
反應(yīng)體系：總體積25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2(25 mmol/L)1．5μL，Pml、Pm2、PmAl、PmA2(10 pmoL／L)各1 μL，10 mmol／LdNTPs 0．5μL，ddH20 13μL，DNA模板5μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
1．6 PCR產(chǎn)物分析
取5μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠(含0．5μl/mL溴化乙錠)在80 V電壓下電泳40 min，凝膠成像儀上觀察、拍照結(jié)果。
1．7金黃色葡萄球菌抑菌試驗(yàn)
金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物之一是透明質(zhì)酸酶，A型Pm的莢膜成分對(duì)其敏感，可產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。將分離鑒定的Pm以10 mm的間隔劃線接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基，然后以金黃色葡萄球菌垂直劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察金黃色葡萄球菌接種線周?chē)鶳m是否發(fā)生菌落抑制或消失現(xiàn)象。
2 結(jié)果
2．1細(xì)菌分離培養(yǎng)
在49份PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性病料中分離到7株疑似Pm。分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，初為透明、邊緣整齊的露珠樣菌落，24 h后為灰白色、圓形、微隆起光滑菌落，不溶血；在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠。在加5％胎牛血清的肉湯中振蕩培養(yǎng)12 h出現(xiàn)渾濁。單個(gè)菌落革蘭氏染色見(jiàn)陰性小桿菌，5％胎牛血清肉湯培養(yǎng)36～48h后菌液染色可看到莢膜，美藍(lán)染色可見(jiàn)兩極濃染。7株分離菌均符合多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)特性。
2．2生化試驗(yàn)
7株分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，均與多殺性巴氏桿菌生化特性相符合。

2．3 Pm種的PCR鑒定
7株分離菌均擴(kuò)增出大小為457 bp的目的條帶，為多殺性巴氏桿菌。
2．4金黃色葡萄球菌抑菌試驗(yàn)
在金黃色葡萄球菌接種線周?chē)?株P(guān)m周?chē)霈F(xiàn)明顯生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，初步判定為A型Pm。
2．5 Pm型的PCR鑒定
7株P(guān)m均擴(kuò)增出大小約1 048 bp大小的的目的條帶，屬于A型Pm。
3討論
多殺性巴氏桿菌是豬繁殖與呼吸道綜合征發(fā)病過(guò)程中主要繼發(fā)病原菌之一。在49份PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性的病料中，分離到細(xì)菌l8株，經(jīng)鑒定7株為Pm，2株為副豬嗜血桿菌，3株為鏈球菌，其他細(xì)菌6株，其中Pm檢出率為l4．3％(7／49)，與副豬嗜血桿菌4．1％(2／49)、鏈球菌6．1％(3／49)的檢測(cè)結(jié)果相比，Pm分離率最高，顯示安徽省豬“高熱病”的發(fā)生與PRRSV引起的繼發(fā)或混合感染Pm密切相關(guān)。因此，在加強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等重大疫病免疫的同時(shí)，應(yīng)增強(qiáng)豬體抵抗力，減少應(yīng)激，防止細(xì)菌繼發(fā)感染。
根據(jù)莢膜抗原的不同，Pm分為A、B、D、E、F共5個(gè)血清型，其中A、B和D型已在豬中發(fā)現(xiàn)，從肺炎病例中分離出的最常見(jiàn)血清型是A型。Pijoan從肺臟分離的Pm有87．5％為A型，l2．5％為D型；Robea報(bào)道從有肺炎癥狀豬分離的Pm 75％為A型，l3％為D型；李永明等對(duì)13株P(guān)m進(jìn)行莢膜抗原PCR的檢測(cè)顯示8株為A型。本次試驗(yàn)主要是從發(fā)病豬的肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離，7株P(guān)m均屬于A型，與國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道相一致，從而表明A型是當(dāng)前繼發(fā)感染的多殺性巴氏桿菌的主要血清型。由于Pm的各血清型之間多無(wú)交叉免疫反應(yīng)性，因此分析當(dāng)?shù)亓餍械腜m血清型對(duì)于該病的防治及疫苗的研究具有意義。
目前對(duì)豬多殺性巴氏桿菌病的微生物學(xué)診斷常采用病變組織的涂片染色鏡檢和病原分離、生化反應(yīng)及動(dòng)物試驗(yàn)等，若要鑒定莢膜抗原型還需用抗血清甚或單克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。在豬多殺性巴氏桿菌病的快速診斷上，常規(guī)方法存在著一定的局限性。本試驗(yàn)同時(shí)采用了常規(guī)方法和PCR技術(shù)進(jìn)行Pm分離鑒定，其結(jié)果相一致。由于PCR技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，并且可以進(jìn)行莢膜抗原型的特異性檢測(cè)，避免了血清學(xué)鑒定的不便，因此在Pm及其血清型的鑒定方面，PCR方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

海棠

在我們的臨床診斷中，伴隨藍(lán)耳病的主要還是付豬嗜血桿菌和鏈球菌。

zhangxinlq

在臨床上繼發(fā)感染后控制難度比較大