飼料專用低溫淀粉酶

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一種低溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

         

（ 杭州保安康生物技術(shù)有限公司，浙江杭州311508）

      

    摘要：經(jīng)分離純化及誘變育種得到一株低溫α-淀粉酶高產(chǎn)菌株。研究結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)生的酶是一種內(nèi)切型淀粉酶，最適作用溫度為50℃，最適作用pH為5.2。該酶具有較好的耐熱性和耐酸性，經(jīng)85℃高溫制粒，酶活存留率達(dá)88.1%；用pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，酶活存留率達(dá)90%以上。體外模擬耐胃蛋白酶試驗(yàn)，證明胃蛋白酶對(duì)該低溫α-淀粉酶無(wú)影響。對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，分子量集中在5000以下，比例達(dá)到70.26%。

      

    關(guān)鍵字：低溫α-淀粉酶；酶學(xué)性質(zhì)        

      

    淀粉是單胃動(dòng)物能量的主要來(lái)源，其供能占總能量需求的60%～80%。幼齡動(dòng)物消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。隨著動(dòng)物日糧配方的富營(yíng)養(yǎng)化、飼養(yǎng)條件應(yīng)激和環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越突出，成年健康動(dòng)物添加“外源性營(yíng)養(yǎng)消化酶”的作用也越來(lái)越明顯，意義也越來(lái)越大。通過(guò)添加外源性淀粉酶來(lái)提高飼料淀粉的消化吸收，對(duì)于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、節(jié)約飼料資源意義重大[1]。

      

    目前飼料專用淀粉酶的研究開(kāi)發(fā)較少，一般均采用食品加工、化纖、印染等工業(yè)用酶。中溫α-淀粉酶是飼料工業(yè)中應(yīng)用最多的淀粉酶，其最適作用溫度為70℃～80℃，pH5.0以下失活嚴(yán)重。動(dòng)物生理環(huán)境溫度—般為37℃～42℃，胃內(nèi)pH較低，中溫淀粉酶在動(dòng)物消化道內(nèi)發(fā)揮作用甚微。低溫淀粉酶最適作用溫度比中溫淀粉酶要低20℃～30℃，因此研究開(kāi)發(fā)低溫淀粉酶對(duì)飼料用酶而言，具有重要意義。

      

本研究對(duì)低溫淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在為飼料專用淀粉酶的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

      

1 材料和方法        

      

1.1 菌種 從采集到的樣品中分離純化并經(jīng)誘變育種得到。

      

1.2 培養(yǎng)基        

      

固體發(fā)酵培養(yǎng)基

      

      麩皮50%，大豆粉25%，玉米粉15%，玉米芯7%，葡萄糖2%，酵母膏0.35%，MgSO4 0.04%，KH2PO4 0.1%，CaCl2 0.01%，NH4Cl 0.5%。

      

1.3 藥品和試劑

      

1.3.1 0.05 mol 硫代硫酸鈉：

      

13g Na2S2O3·5H20和0.1 g 無(wú)水碳酸鈉定容1000mL。

      

1.3.2 費(fèi)林試劑

      

-----銅溶液：硫酸銅34.66 g 溶解在水中，定容至500 mL。

      

-----酒石酸鉀鈉堿溶液：酒石酸鉀鈉173 g 和氫氧化鈉50 g 溶解在水中，定容至500 mL。

      

-----使用前，精確地取等體積的銅溶液和堿液充分混合。

      

1.4 低溫淀粉酶活力的測(cè)定方法

      

將可溶性淀粉溶液10ml加到100mlErlenmyer三角瓶中，置于（40±0.5）℃恒溫水浴中。預(yù)熱10min-15min,加入樣品稀釋酶液1ml.準(zhǔn)確加熱30min后。加入費(fèi)林試劑4ml使酶失活。將三角燒瓶直接在煤氣噴燈（或電爐）上加熱2min后，立即放在自來(lái)水中冷卻。隨后，加入30%碘化鉀溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定游離出的碘，以藍(lán)色小時(shí)作為滴定終點(diǎn)T30（ml）
  空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以水取代酶液。在另一個(gè)三角燒瓶中用上述同樣的操作步驟測(cè)定空白對(duì)照值T0(ml).臨近終點(diǎn)時(shí)，加入1%可溶性淀粉溶液1滴-2滴，以藍(lán)色消失作為滴定終點(diǎn)。

      

一個(gè)酶活力單位定義為1g固體酶粉（或1mL液體酶），于40℃、pH=5.0條件下，反應(yīng)30min，反應(yīng)液中產(chǎn)生相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖所需的酶量。

      

淀粉酶活力（u/ml）=（T0-T30）×f×1.62×1/10×n

      式中：T30----酶反應(yīng)液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml
   T0----空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml
   f----0.05mol/l硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數(shù)
   1.62----換算系數(shù)
   1/10----該分析方法的常數(shù)（相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖）
   n----樣品的稀釋倍數(shù)      

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      

2.1 產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵培養(yǎng)與活力檢測(cè)

      

    將經(jīng)過(guò)篩選和育種得到的菌株接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)50h。烘干、粉碎后測(cè)定低溫淀粉酶活力，酶活最高達(dá)3820U/g。

      

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的研究        

      

2.2.1 低溫淀粉酶作用溫度的研究

      

在pH5.0 的酶活測(cè)定反應(yīng)體系中，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃溫度下測(cè)定酶活，溫度對(duì)酶活的影響如圖1。

                                                

                                                        圖1 溫度對(duì)酶活的影響

      

Fig.1 The effect of temperature on relative activity

      

    由圖可知，該低溫淀粉酶最適作用溫度為50℃，在35～60℃之間均有較高的酶活。

      

2.2.2 低溫淀粉酶的最適作用pH

      

在40℃的酶活測(cè)定反應(yīng)體系中，分別調(diào)節(jié)pH為2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按照低溫淀粉酶的酶活力測(cè)定方法測(cè)定酶活，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

                                                                           
                                         

圖 2 pH對(duì)酶活的影響

      

Fig.2 The effect of temperature on relative activity

      

由圖可知，該低溫淀粉酶最適作用pH為5.2，在pH4.0～6.0之間均有較高的酶活。

      

2.2.3 酶的熱穩(wěn)定性

      

     為了準(zhǔn)確評(píng)估低溫淀粉酶經(jīng)飼料高溫制粒后的實(shí)際存留率，本試驗(yàn)在飼料中添加20%的淀粉酶，然后進(jìn)行85℃高溫制粒后進(jìn)行評(píng)估，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

                                       

圖 3 酶的熱穩(wěn)定性

      

Fig.3 Thermal stability of enzyme

      

由圖3可知，制粒前低溫淀粉酶理論值為624U/g，實(shí)際檢測(cè)值為603U/g，經(jīng)過(guò)85攝氏度制粒后酶活為531 U/g ，酶活存留率達(dá)到88.1%，說(shuō)明在高溫制粒過(guò)程中低溫淀粉酶具有較好的耐受性能，適用于飼料制粒工藝。

      

2.2.4低溫淀粉酶的耐酸性評(píng)估

      

將制得的酶液分別用pH3.5、4.0、4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理0h、1h、2h、3h、4h，測(cè)定淀粉酶活力，結(jié)果如圖四所示。

            

圖 3低溫淀粉酶的耐酸性

      

Fig.4 Acid resistance of enzyme

      

     用pH3.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留80%以上，經(jīng)pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留90%以上，說(shuō)明該淀粉酶耐酸性良好。

      

2.2.5 體外模擬耐胃蛋白酶實(shí)驗(yàn)

      

     模擬動(dòng)物體內(nèi)生理環(huán)境溫度40℃，加入1mg/mL的新鮮胃蛋白酶鹽溶液（0.1N，pH3.5），處理5h，每隔1h測(cè)定淀粉酶活。

            

圖 5 耐胃蛋白酶實(shí)驗(yàn)

      

Fig.5 Resistance to pepsin experiment

      

由圖可知，在pH3.5、溫度40℃、用1mg/mL的胃蛋白酶溶液處理淀粉酶5h后，淀粉酶活力存留仍在80%以上。

      

2.2.6 HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物的分析

      

取一定量5%的淀粉溶液，預(yù)熱保溫40℃，加入一定量的低溫淀粉酶，控制反應(yīng)時(shí)間為30min，然后沸水浴5min使酶失活，微孔膜過(guò)濾后，利用HPLC分析樣品中各物質(zhì)的分子量分布，圖譜峰見(jiàn)圖6。

                                                                     

保留時(shí)間	重均	重均/數(shù)均	%
8.055	4539	1.34742	52.7026
8.643	1586	1.00603	10.1598
8.955	1245	1.00315	6.3192
9.295	1015	1.00207	1.0784

      

圖5 低溫淀粉酶酶解產(chǎn)物HPLC圖譜

      

Fig.6 HPLC analysis of starch solution by cold-adapted amylase

      

    從圖譜可看出，低溫淀粉酶酶解產(chǎn)物分子量多集中于5000以下，占酶解物總量的70.26%。

      

3 結(jié)論與討論

      

    通過(guò)分離純化篩選到的菌株，產(chǎn)淀粉酶活力能夠達(dá)到3820U/g，同國(guó)內(nèi)報(bào)道的低溫淀粉酶菌株相比，具有較高的研究應(yīng)用價(jià)值[9,10]。該淀粉酶是一種內(nèi)切型α-淀粉酶，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適作用pH為5.2，在pH4.0～6.0之間具有較高活性；該低溫淀粉酶有較好的耐酸性和耐熱性，用pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留90%以上，經(jīng)過(guò)85℃高溫制粒后，酶活存留率為88.1%。采用體外模擬耐胃蛋白酶試驗(yàn)，證明胃蛋白酶對(duì)其無(wú)影響。

      

    從酶學(xué)性質(zhì)分析，該菌株生產(chǎn)的低溫α-淀粉酶適合動(dòng)物消化道環(huán)境條件，能夠耐受高溫制粒，在飼料行業(yè)有很大的應(yīng)用前景。

      
      

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