豆粕與發(fā)酵豆粕中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子調(diào)查分析

畜牧編輯

　　導(dǎo)讀

　　【研究意義】豆粕是大豆加工副產(chǎn)品，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量為40%—50%，脂肪為1%—2%，碳水化合物約為10%—15%，且較魚粉價(jià)格低，是目前最廣泛使用的植物性蛋白質(zhì)飼料原料。但豆粕中存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、寡糖等，會造成畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率降低。目前消除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的主要方法包括物理法、化學(xué)法、微生物發(fā)酵法及添加酶制劑法，其中微生物發(fā)酵法安全、健康、高效，可最大限度地降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并產(chǎn)生乳酸、維生素、益生菌等活性物質(zhì)。然而由于發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝及豆粕本身特性的差異，目前市場上發(fā)酵豆粕產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊?；诖?，有必要對現(xiàn)行市場上流通的豆粕和發(fā)酵豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平進(jìn)行調(diào)查分析，為其在飼料中的合理使用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

　　【前人研究進(jìn)展】目前研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可明顯降低豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白、脲酶的含量。Hirabayashi 等使用宇佐美曲霉發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后豆粕中的植酸全部被降解。Feng 等使用產(chǎn)蛋白酶菌—米曲霉發(fā)酵豆粕，可完全消除豆粕中胰蛋白酶抑制因子。此外發(fā)酵還可以提高粗蛋白質(zhì)、氨基酸、多種活性物質(zhì)的含量，同時(shí)產(chǎn)生特殊氣味，提高動(dòng)物適口性。

　　【本研究切入點(diǎn)】本研究分析了6 種對動(dòng)物健康和發(fā)育有較大影響的抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括熱不穩(wěn)定性的胰蛋白酶抑制因子、脲酶和熱穩(wěn)定性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、棉籽糖以及水蘇糖。其中脲酶活性是評價(jià)豆粕營養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)；胰蛋白酶抑制因子受其分析方法的限制少有人檢測，往往是通過脲酶活性對其進(jìn)行間接評價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)脲酶含量并不能客觀反映胰蛋白酶抑制因子的變化。棉籽糖和水蘇糖占低聚糖總量的90%，具有熱穩(wěn)定性，加熱不能使其失活，同時(shí)不同的發(fā)酵工藝對兩種低聚糖的消除情況也不盡相同；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白是兩種主要的抗原蛋白，不能通過簡單的加熱使其鈍化。因此有必要對市場流通的豆粕及發(fā)酵豆粕中上述6 種抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量水平進(jìn)行調(diào)查分析。

　　【擬解決的關(guān)鍵問題】采用HPLC 測定棉籽糖和水蘇糖含量，應(yīng)用ELISA 法對β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的含量進(jìn)行測定，而脲酶采用國標(biāo)方法進(jìn)行測定。比較豆粕與發(fā)酵豆粕中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，總結(jié)二者中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的正常值范圍，對當(dāng)前市場上的豆粕及發(fā)酵豆粕質(zhì)量進(jìn)行分析。

　　1材料與方法
　　1.1 儀器與試劑

　　高效液相色譜儀、高速離心機(jī)、渦旋儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、酸度計(jì)、水浴鍋、酶標(biāo)儀。大豆胰蛋白酶抑制因子定量檢測試劑盒、大豆球蛋白定量檢測試劑盒、β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒。棉籽糖和水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%），乙醇水溶液（濃度為70%），試驗(yàn)用水為Millipore 純水系統(tǒng)制得的高純水，乙腈為HPLC 純；尿素緩沖液pH 7.0±0.1（稱取8.95 g 磷酸氫二鈉，3.4 g 磷酸二氫鉀溶于水，再將30 g 尿素溶在此緩沖液中）、鹽酸溶液C（HCl）=0.1 mol·L-（1 稱取8.3 mL鹽酸用水稀釋至1 000 mL）、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液C（NaOH）=0.1 mol·L-1（稱取4 gNaOH 用水稀釋至1 000 mL）。

　　1.2 樣品來源

　　樣品來源：山東、河南、天津、北京、遼寧、黑龍江、河北、江蘇、浙江、重慶10 個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）經(jīng)營和使用環(huán)節(jié)的65 批次豆粕；山東、河南、廣東、北京、浙江、江西、江蘇、湖北、上海、天津、遼寧、四川、福建13 個(gè)省（市、自治區(qū)）經(jīng)營和使用環(huán)節(jié)的54 批次發(fā)酵豆粕。取樣地區(qū)和數(shù)量見表1。

　　1.3 樣品測定方法
　　1.3.1 棉籽糖和水蘇糖的測定

　　參考文獻(xiàn)并進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對提取方法、料液比、提取液濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定試驗(yàn)方案。該試驗(yàn)的優(yōu)化及試驗(yàn)方案另文撰寫。

　　1.3.2 脲酶的測定

　　參照GB/T8622-2006《飼料用大豆制品中脲酶活性的測定》測定豆粕和發(fā)酵豆粕中的脲酶。

　　1.3.3 大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，胰蛋白酶抑制因子的測定

　　ELISA 測定過程參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。具體過程如下：稱取一定質(zhì)量樣品（抗原蛋白0.300 g，胰蛋白酶抑制因子0.100 g，均精確到0.001 g）于50 mL 離心管中，加入30 mL 提取液，于25℃振蕩16 h，靜置2 min 后，離心5 min（4 000 r/min），取上清液并稀釋70 倍。將樣品盒標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)液平行測定兩次，記錄校準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置，經(jīng)過加樣、洗板、加酶標(biāo)試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm 雙波下讀取吸光度值。按照下列公式計(jì)算吸光率：百分吸光率(%)=B/B0×100%其中，B 為校準(zhǔn)品或樣品的平均吸光度值，B0 是標(biāo)準(zhǔn)品1 的平均吸光度值。校準(zhǔn)曲線的繪制：以校準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.4 數(shù)據(jù)分析

　　試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2012 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并采用百分位數(shù)法進(jìn)行分析。

　　2結(jié)果
　　2.1 豆粕和發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白的含量分析

　　利用ELISA 試劑盒分析豆粕和發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白，結(jié)果見表2。發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白平均含量比豆粕減少57.7%。從圖1-a 可明顯看出，90%的豆粕中大豆球蛋白含量聚集在60—180 mg·g-1 范圍內(nèi)，而90%的發(fā)酵豆粕中的大豆球蛋白含量主要集中在0—120 mg·g-1。采用百分位數(shù)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出豆粕P90（90%的檢測值小于P90）是177.3 mg·g-1，發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白含量的百分位數(shù)值P90 是109.4mg·g-1?？梢酝茢喑龆蛊芍械拇蠖骨虻鞍缀空Ｖ捣秶?8.9—P90（177.3 mg·g-1）之間，發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為ND—P90（109.4 mg·g-1）。

　　2.2 豆粕和發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量分析

　　結(jié)合表2 發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白平均含量相較于豆粕降低了63.2%。圖1-b 揭示了豆粕和發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量聚集范圍及變化趨勢，所調(diào)查的65 批次豆粕中β-伴大豆球蛋白含量主要集中在42.8—150 mg·g-1范圍內(nèi)，含量百分比約85%，而54批次的發(fā)酵豆粕中的β-伴大豆球蛋白含量主要聚集在0—60 mg·g-1 范圍內(nèi)，所占百分比為83%。采用百分位數(shù)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位數(shù)值P85 是147.2 mg·g-1，而發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位數(shù)值P85 是53.8 mg·g-1，由這些數(shù)據(jù)可以判斷豆粕及發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范圍分別為42.8—P85（147.2 mg·g-1）和ND—P85（61.8 mg·g-1）。

　　2.3 豆粕和發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量分析

　　胰蛋白抑制因子平均含量在發(fā)酵豆粕中比在豆粕中降低了59.1%（表2），此結(jié)果與陳斌在微生物發(fā)酵對豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子及營養(yǎng)價(jià)值的影響中的胰蛋白酶抑制因子下降了50.4%的結(jié)果相近。從圖1-c 中可以看出發(fā)酵豆粕和豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量變化趨勢及主要集中范圍，二者均較低且主要分布在0—40 mg·g-1 范圍內(nèi)，但發(fā)酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子比豆粕中的胰蛋白酶抑制因子低，其中80%的發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量在0—10 mg·g-1，而80%豆粕胰蛋白酶抑制因子的含量主要聚集在0—30mg·g-1，豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 為28.6 mg·g-1，發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 為9.9 mg·g-1，采用百分位數(shù)法分析進(jìn)一步表明發(fā)酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量降低，豆粕及發(fā)酵豆粕胰蛋白抑制因子含量正常值范圍應(yīng)為ND—P80（28.6 mg·g-1）、ND—P80（9.9 mg·g-1）。

　　2.4 豆粕和發(fā)酵豆粕中低聚糖的含量分析

　　液相色譜檢測低聚糖方法最小檢出限為0.01mg·g-1，發(fā)酵豆粕中棉籽糖平均含量比豆粕減少了82.5%、水蘇糖平均含量降低了82.5%（表2）。從圖1-d 中可以看出90%的發(fā)酵豆粕中棉籽糖含量在0—6mg·g-1 范圍內(nèi)，而90%豆粕中棉籽糖的含量在6—15mg·g-1 范圍內(nèi)。86%的豆粕中水蘇糖含量在21—42mg·g-1 范圍內(nèi)，而87%的發(fā)酵豆粕中水蘇糖含量在0—14 mg·g-1 范圍內(nèi)。采用百分位數(shù)法對這一結(jié)果進(jìn)行分析，豆粕中的棉籽糖含量P90 為13.79 mg·g-1，而棉籽糖在發(fā)酵豆粕的含量P90為4.65 mg·g-1 。豆粕P85中的水蘇糖含量為33.29 mg·g-1，發(fā)酵豆粕中水蘇糖含量P85 為11.58 mg·g-1，以上數(shù)據(jù)充分說明了發(fā)酵豆粕中

　　圖1 豆粕及發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量百分比（大豆球蛋白：a；β-伴大豆球蛋白：b；胰蛋白酶抑制因子：c；棉籽糖：d；水蘇糖：e）

　　低聚糖含量普遍低于豆粕。豆粕和發(fā)酵豆粕中棉籽糖含量正常值范圍為ND—P90（13.79 mg·g-1）、ND—P90（4.65 mg·g-1），水蘇糖的含量正常值范圍為ND—P85（33.29 mg·g-1）、ND—P85（11.58 mg·g-1）。

　　2.5 豆粕和發(fā)酵豆粕中脲酶的活性分析

　　采用百分位數(shù)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出豆粕中脲酶百分位數(shù)值P90是0.19 U·g-1，P97 是0.40 U·g-1，符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的飼用豆粕的脲酶含量為0.02—0.45 U·g-1，由這些數(shù)據(jù)可以判定，豆粕中脲酶含量正常值范圍應(yīng)在ND—P97（0.40 U·g-1）之間。發(fā)酵豆粕中的脲酶未檢出，結(jié)果表明發(fā)酵可以顯著降低脲酶活性。

　　3討  論

　　本次調(diào)查抽取的65 批次豆粕和54 批次發(fā)酵豆粕經(jīng)檢測分析表明發(fā)酵豆粕所含的不同種類的抗?fàn)I養(yǎng)因子的量比豆粕低，但不乏部分發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量居高的現(xiàn)象，可能是加工程度、發(fā)酵工藝、大豆品種的問題。

　　3.1 與現(xiàn)有報(bào)道中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量比較

　　本抽樣調(diào)查的65 批次豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為58.9—177.3 mg·g-1，小于文獻(xiàn)總結(jié)的豆粕中的含量400 mg·g-1，而54 批次的發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為≤109.34 mg·g-1，超出了文獻(xiàn)中的含量范圍＜0.02 mg·g-1，說明現(xiàn)行市場中的發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白含量普遍居高。豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范圍是42.8—185.8 mg·g-1，89%的豆粕在≤155 mg·g-1范圍內(nèi)，而其在發(fā)酵豆粕中的含量正常值范圍為≤61.8 mg·g-1，超過了文獻(xiàn)中的的含量范圍≤0.01 mg·g-1。胰蛋白酶抑制因子含量正常值范圍為≤28.6 mg·g-1，與胰蛋白酶抑制因子在豆粕中的含量為2%左右一致。豆粕中棉籽糖含量正常值范圍為≤13.79 mg·g-1，接近1%，豆粕中水蘇糖含量正常值范圍≤33.29 mg·g-1 與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，發(fā)酵豆粕的棉籽糖含量正常值范圍為≤4.65 mg·g-1，發(fā)酵豆粕中水蘇糖含量正常值范圍為≤11.58 mg·g-1，合計(jì)為≤16.23 mg·g-1，與現(xiàn)有報(bào)道中＜0.9%有一定的出入。豆粕中脲酶活性范圍≤0.40 U·g-1，發(fā)酵之后脲酶活性未檢出，則說明發(fā)酵之后脲酶完全降解，該結(jié)果與現(xiàn)有研究中關(guān)于黑曲霉發(fā)酵豆粕中脲酶全部被降解的結(jié)果相一致。根據(jù)研究結(jié)果，豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量基本與現(xiàn)有研究結(jié)果相符，但發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的含量居高，表明現(xiàn)在的發(fā)酵工藝對胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、脲酶的鈍化水平高于對抗原蛋白的消除水平。此外，不同的發(fā)酵豆粕中同種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量差異較大，部分產(chǎn)品的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量與豆粕相當(dāng)，因此發(fā)酵工藝，豆粕質(zhì)量是影響發(fā)酵后抗?fàn)I養(yǎng)因子鈍化程度的重要原因。

　　3.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子鈍化情況的比較

　　抗?fàn)I養(yǎng)因子在發(fā)酵過程中鈍化機(jī)理不同導(dǎo)致其消除程度也會有差異。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量降低的程度趨于一致，分別為57.71%、63.2%、59.08%。這可能是由于豆粕中的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵分解，使抗原蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量下降。

　　3.3 抗?fàn)I養(yǎng)因子之間的含量比較

　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豆粕和發(fā)酵豆粕中，6 種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量排序均為大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白＞胰蛋白酶抑制因子＞水蘇糖＞棉籽糖＞脲酶，與現(xiàn)有研究報(bào)道相一致。有研究表明，仔豬腸道對日糧抗原過敏，從而導(dǎo)致腸道損傷，是仔豬斷奶后腹瀉和生長發(fā)育受阻的一項(xiàng)主要原因。胰蛋白酶抑制因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在抑制動(dòng)物生長，降低胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化，并造成胰腺腫大等方面，但目前豆粕的質(zhì)量評價(jià)只通過測定脲酶活性間接反映胰蛋白酶抑制因子的含量，但脲酶活性是豆粕中起最低抗?fàn)I養(yǎng)作用的因素且在發(fā)酵過程中脲酶可基本全部降解，不能準(zhǔn)確反映胰蛋白酶抑制因子鈍化情況。此外，過量的大豆寡糖，易引起動(dòng)物腹鳴、腹脹、腹瀉，雖然含量低于前3 個(gè)抗?fàn)I養(yǎng)因子，但其抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)顯著為保證動(dòng)物健康。綜上，有必要對這6 種抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)行鈍化并對其含量進(jìn)行測定。

　　4結(jié)  論

　　本研究調(diào)查分析了市場中的65 批次豆粕和54 批次的發(fā)酵豆粕，其中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)行了含量分析。結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低于豆粕，由于不同廠家使用菌種種類、菌種數(shù)目、加工工藝的不同其含量不完全相同，建議對豆粕質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)中加入對動(dòng)物影響較大的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量分析，更全面地測定并反映豆粕及發(fā)酵豆粕的質(zhì)量。同時(shí)本研究中推斷出抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量正常值范圍，有助于了解現(xiàn)行市場的豆粕和發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量水平，并對飼料企業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)對豆粕及發(fā)酵豆粕的選擇有指導(dǎo)意義。

　　（來源：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)；作者：楊玉娟, 姚怡莎, 秦玉昌等）

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