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6樓
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發(fā)表于 2006-3-17 19:00:00
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我來發(fā)一個吧植物中的
植物組織中丙二醛含量的測定
植物器官衰老或在逆境下遭受傷害,往往發(fā)生膜脂過氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物,從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后,與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征;使纖維素分子間的橋鍵松馳,或抑制蛋白質(zhì)的合成。MDA的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害。
原理
丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標,在酸性和高溫度條件下,可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川(3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮),其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾,其中最主要的是可溶性糖,糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm,532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加,因此測定植物組織中MDA—TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值,所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子,通常植物組織中鐵離子的含量為100~300μg/g DW,根據(jù)植物樣品量和提取液的體積,加入Fe3+的終濃度為0.5μmol/L。A. 直線回歸法 MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖(0~25mmol/L)與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關(guān),配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后,測定上述三個波長的消光度值,求其直線方程,可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為:
Y532=﹣0.00198+0.088D450 ①
B.雙組分分光光度計法
據(jù)朗伯-比爾定律:D=kCL,當液層厚度為1cm時,k=D/C,k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時,某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光度之和。 已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40,7.40。MDA在450nm波長下無吸收,故該波長的比吸收系數(shù)為0,532nm波長下的比吸收系數(shù)為155,根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組,求解方程得計算公式:
C1(mmol/L)=11.71D450 ②
C2(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 ③
式中 C1-為可溶性糖的濃度;
C2-為MDA的濃度;
D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。
試劑 10%三氯乙酸(TCA);0.6%硫代巴比妥酸,先加少量的氫氧化鈉(1mol/L)溶解,再用10%的三氯乙酸定容;石英砂。
方法 1. 實驗材料 受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。 2. MDA的提取 稱取剪碎的試材1g,加入2ml 10%TCA和少量石英砂,研磨至勻漿,再加8ml TCA進一步研磨,勻漿離心(4000×g)10min,上清液為樣品提取液。 3. 顯色反應(yīng)和測定 吸取離心的上清液2ml(對照加2ml蒸餾水),加入2ml 0.6%TBA溶液,混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min,迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。 4. 計算含量 (1) 直線方程法 按公式①求出樣品中糖分在532nm處的消光度值Y532,用實測532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532,其差值為測定樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液中MDA濃度。 (2) 雙組分分光光度法 按公式③可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。 用上述任一方法求得MDA的濃度,根據(jù)植物組織的重量計算測定樣品中MDA的含量:
MDA(μmol/g FW)=C×V/W
式中 C-MDA濃度(μM);
V-提取液總體積(ml);
W-植物組織鮮重(g)。
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