傳染性副豬嗜血桿菌病的研究進展

戲雨尋風(fēng) · 發(fā)表于 2006-10-22 19:17:41

傳染性副豬嗜血桿菌病的研究進展

　　近年來,國內(nèi)外無多豬場出現(xiàn)了一種以發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎及高死亡率為特征,嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失.經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和分子生物學(xué)試驗表明,該傳染病主要是由副豬嗜血桿菌(Hp.S)所引起.為了更加全面地、本質(zhì)地認(rèn)識該病病原體,本文對其流行病學(xué)、理化特性、分子生物學(xué)、診斷及防制作了較為全面的綜述.

　　同繁殖障礙性傳染病、胃腸道傳染病一樣,呼吸道傳染病是危害養(yǎng)豬業(yè)的三大癥侯群之一.不同的是,由于傳統(tǒng)技術(shù)和生物技術(shù)的應(yīng)用及對繁殖障礙和胃腸道傳染病病原體的研究的深入研究,相繼研制出優(yōu)質(zhì)高效的疫苗和靈敏特異的診斷方法,使得繁殖障礙和胃腸道傳染病暴發(fā)流行的態(tài)勢受到遏制;但是近幾年來隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,呼吸道疾病呈遞增趨勢,尤其是以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎及高死亡率為特征的傳染病給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失.因此,有必要對該病原體的研究做出全面的了解,現(xiàn)綜述如下:

　　一、流行病學(xué) 引起豬傳染性胸膜肺炎的病原菌有三種,即胸膜肺病炎放線桿菌(AP,過去稱為副溶血桿菌HP)、豬嗜血桿菌(Hs)、副豬嗜血桿菌(Hp.s).副豬嗜血桿菌自1910年的以來就作為病原菌而被認(rèn)為是豬Glasser病的病原體.然而,直到九十年代人們才花了較多的精力對其發(fā)病和防制進行了研究. 該病又稱為革拉澤氏病(G]assaytS Disease),可以影響從2周齡到4月齡的青年豬,主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病,通常見于5-8周齡的豬,發(fā)病率一般在10-15%,嚴(yán)重時死亡率司達到50%.主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽,呼吸困難,消瘦,被毛粗亂,食欲不振,厭食,反應(yīng)遲鈍,疼痛(由尖叫推斷),關(guān)節(jié)腫脹,跛行,顫抖,共濟失調(diào),可視粘膜發(fā)紺,側(cè)臥,隨之可能死亡.急性感染后可能留下后遺癥,即母豬流產(chǎn),公豬慢性跛行.即使應(yīng)用抗菌素治療感染母豬,分娩時也可能引發(fā)嚴(yán)重疾病.因該病造成的哺乳母豬的慢性跛行可能引起母性行為極端弱化.總之,發(fā)熱、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂是主要的臨床癥狀.肉眼可見的損傷主要是在單個或多個漿膜面,可見漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物.這些漿膜包括腹膜,心包膜和胸膜,這些損傷也可能涉及腦和關(guān)節(jié)表面,尤其是腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié).在顯微鏡下觀察滲出物,司見纖維蛋白,中性粒細(xì)胞和較少量的巨噬細(xì)胞.副豬嗜血桿菌也可能引起急性敗血癥,在不出現(xiàn)典型的漿膜炎時就呈現(xiàn)發(fā)紺,皮下水腫和肺水腫,乃至死亡.另據(jù)報道,副豬嗜血桿菌還可能引起筋膜炎和肌炎,以及化膿性鼻炎等. 早在1910年,德國學(xué)者Glasser就發(fā)現(xiàn)了副豬嗜血桿菌與豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎之間的聯(lián)系.此后,在大量從臨床病料中分離細(xì)菌的基礎(chǔ)上,人們對副豬嗜血桿菌的研究逐步走向深入.

　　在豬繁殖呼吸綜合征、Ⅱ型豬圓環(huán)病毒所致疾病(斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)、偽狂犬病及豬流感等感染之后,這類細(xì)菌分離的頻率,甚至從漿液性漿膜炎病例中的分離頻率一直都在增高.對于豬呼吸道疾病,如支原體肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、豬流感、偽狂犬病和豬呼吸道冠狀病毒等感染時,副豬嗜血桿菌的存在可加劇病情的臨床表現(xiàn). 隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病.由于飼養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整進行不當(dāng),以及突發(fā)新的呼吸道綜合征,使得該病日趨流行,危害日漸嚴(yán)重.近年來,隨著養(yǎng)殖水平的提高,副豬嗜血桿菌在我國各豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮,已從北京、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北、上海、福建、山東、河北等省市分離出副豬嗜血桿菌,其損失相當(dāng)慘重.如湖南某豬場有母豬240余頭,仔豬1000余頭,架子豬700余頭,1999年4月開始發(fā)病,母豬病死率30%一40%;仔豬有100余頭發(fā)病,死亡100余頭,病死率90%以上;架子豬病死率20%,經(jīng)病原分離鑒定、生化試驗和動物感染試驗,證明是副豬嗜血桿菌感染.

　　按Kieletein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法,目前副豬嗜血桿菌至少可分為15個血清型,其中在德國4、5型最為流行,在澳大利亞5型、13型最為流行,在美國5型最為流行.研究人員也同時指出,20%以上的分離株不能分型.但是,我國的地方分離株雖多次報道,但由于該菌的分離培養(yǎng)和保存極其困難,尚未有人對其進行過全面的生化鑒定,更未進行系統(tǒng)的血清分型研究.除了KRG血清分型方法之外,研究者也嘗試用整個細(xì)菌體裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳,對副豬血桿菌進行分型,結(jié)果除KRG血清型1型為SDS-PAGEIII型外,其它血清型,如5型、6型、10型均屬SDS-PAGEI型. 副豬嗜血桿菌只感染豬,可以影響從2周齡到4月齡的仔豬和青年豬,主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病,通常見于5-8同齡的豬,發(fā)病率可達40%,嚴(yán)重時死亡率可達50%.細(xì)菌通?？蓮慕】地i的鼻腔分泌液中分離出來,還可以從患肺炎豬的肺臟中分離出來.在分離的15種血清型菌株中,1、5、10、12、13、14毒力最強,患豬歸于死t_或處于瀕死狀態(tài);2、4、8、15型為中等毒力,患豬死亡率低,但出現(xiàn)敗血癥狀,生長遲滯;3,6,7,9和1 1型表現(xiàn)較好,患豬沒有明顯的臨床癥狀. 此外,Morozumi T等研究表明,2億個副豬嗜血桿菌可使小鼠致死,并能從肺臟中分離出Hp.s;1億到16億個范圍的Hp.s可使豚鼠致死,并能從多個臟器甚至大腦中分離出Hp.s,從而確立了小鼠和豚鼠町以作為Hp.S研究模型動物.最近的研究發(fā)現(xiàn),tlp.S感染豬時,伴隨著急性和慢性肺炎癥狀.肺泡液中細(xì)胞因子發(fā)生變化,在支氣管接種Hp.s 24小時后,血漿中自介素6的濃度迅速升高,從而影響了血細(xì)胞的功能.肺臟的病變及多處器官的損傷嚴(yán)重阻礙了仔豬增重,也改變了育肥豬及肥豬的肉質(zhì)性狀.

　　二、Hp.s的理化特性副豬嗜血桿菌為革蘭氏陰性菌,在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48小時仍然很差,菌落為光滑型,灰白色透明,直徑大約0.5ram.如果與金黃色葡萄球菌同時培養(yǎng),副嗜血桿菌在該菌兩側(cè)生長良好,菌落直徑可達1-2ram.本菌的生長嚴(yán)格需要V因子,不需要x因子,在血液瓊脂上不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象.在加DNA、馬血清的M96支原體培養(yǎng)基或加DNA、馬血清和酵母浸出物的PPLO培養(yǎng)基上生長良好. 有人推測,同其他細(xì)菌一樣,決定Hp.s毒力和致病性的主要因素是細(xì)菌毒素,但這方面的報道較少.有人研究認(rèn)為,細(xì)菌莢膜、外膜蛋白甚至整個細(xì)菌蛋白均與細(xì)菌毒力有關(guān),至于這些蛋白質(zhì)的具體功能還存在爭議.RuizA等研究表明,外膜蛋白(0MP)與Hp.s的毒力有關(guān),從健康仔豬與患病豬分離的Hp.s OMP不同,有多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎癥狀的豬分離的Hp.sOMP基本相同.OMP蛋白質(zhì)共有8種,大小分別約為92KD,88KD,53KD,60KD,46KD,37KD,31KD及】5KD.

　　三、Hp.S分子生物學(xué) 由于副豬嗜血桿菌引起的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及仔豬死亡在近幾年才受到人們的廣泛重視,基礎(chǔ)工作如細(xì)菌分離鑒定、血清分型等工作尚未完成,所以對其分子生物學(xué)研究也并不深入,多數(shù)研究僅停留在個別基因的克隆和序列分析方面.De la quente Redondo VA等以特異性的PCR方法為基礎(chǔ),建立了限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(RFLP)分型方法,他們先克隆了長為1.9kb的tbpA基因,用TaqI、AvaI和RsaI進行酶切分析,對已知15種血清型的Hp.s菌株分析結(jié)果表明,RFLP敏感性及分型能力均比瓊脂擴散方法強,其中RFLP方法為100%,而瓊脂擴散方法僅為65%.此外,學(xué)者們還克隆了Hp.S 16s rRNA基因、外膜蛋白及脂多糖基因,但具體功能尚不清楚.

　　四、診斷與防制

　　(一)診斷疾病診斷通常建立在畜群病史調(diào)查、臨床癥狀和尸體解剖的基礎(chǔ)上,細(xì)菌的分離培養(yǎng)對確診是必要的,但往往不能成功,這是因為副豬嗜血桿菌十分嬌嫩,相對于標(biāo)本中同時可能出現(xiàn)的其它細(xì)菌,難以滿足其生長需要.據(jù)報道,采用回歸分析法分析,副豬嗜血桿菌真實的發(fā)病率可能為實際確診的10倍之多,部分原因是由于不能確認(rèn)采集來的標(biāo)本中是否存在副豬嗜血桿菌.研究人員不僅要對有嚴(yán)重臨床癥狀和損傷的豬進行尸體剖檢,還要對處于疾病急性期的豬在應(yīng)用抗菌素之前采集病料進行細(xì)菌的分離鑒定,細(xì)菌分離培養(yǎng)最好選擇漿膜表面物質(zhì)或滲出的腦脊髓液及心臟血液,即使損傷輕微或不明顯也要這樣做.盡管常規(guī)診斷有些困難,但在加有抗菌素的選擇培養(yǎng)基上接種以后,用特殊的稀釋技術(shù)可成功地在從呼吸道采集來的標(biāo)本中培養(yǎng)出大量細(xì)菌.現(xiàn)在,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病毒室已建立了副豬嗜血桿菌的快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)診斷技術(shù),可對該病作出迅速的診斷. 用生物化學(xué)的檢測方法可將副豬嗜血桿菌從其經(jīng)NAD或V因子依賴的微生物中鑒別開來.有時其它的NAD依賴的細(xì)菌(L類嗜血桿菌,豬放線菌,吲哚放線菌)會被誤認(rèn)為嗜血桿菌,這些細(xì)菌在鼻竇,扁桃體或肺臟中大量存在,但只有較低的致病力.

　　在一個豬群中出現(xiàn)副豬嗜血桿菌的幾個菌株或血清型并非少見,甚至在單個豬上的不同標(biāo)本中也可發(fā)現(xiàn)不同的菌株或血清型.由此,全身各處或大損傷點分離是唯一能保證所分離出來的細(xì)菌在病程中發(fā)揮作用的前提.在血清學(xué)的實驗室診斷方面,主要通過瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗和間接血凝試驗等.血清學(xué)的分型嚴(yán)格要求研究者熟知疾病暴發(fā)的流行病學(xué),以及感染和接種的免疫反應(yīng),這只有少數(shù)幾個實驗室中才能做到. 鑒別診斷要將副豬嗜血桿菌與敗血性細(xì)菌感染相區(qū)別,能引起敗血性感染的細(xì)菌有鏈球菌、豬丹毒絲菌、豬放線桿菌、豬霍亂沙門氏菌、胸膜肺炎放線桿菌以及埃希氏大腸桿菌等.另外,3一10周齡豬的支原體多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎能出現(xiàn)與副豬嗜血桿菌感染相似的損傷.只有熟悉了其它病毒和細(xì)菌病原之后,才能認(rèn)清副豬嗜血桿菌在支氣管肺炎中的作用,這些病原體可能在多因子疾病的病程中產(chǎn)生影響.

　　(二)治療抗生素預(yù)防或口服藥物治療對嚴(yán)重的副豬嗜血桿菌暴發(fā)可能無效.一旦臨床癥狀已經(jīng)出現(xiàn),應(yīng)立即采用口服之外的方式應(yīng)用大劑量的抗菌素進行治療,并且應(yīng)當(dāng)對整個豬群藥物預(yù)防,而不僅僅只是對那些表現(xiàn)出癥狀的豬用藥.可以選用青霉素治療,但有報道說,細(xì)菌對青霉素的抗藥性日漸增強.大多數(shù)副豬嗜血桿菌也對阿莫西林、氟喹諾酮類、頭孢菌素、四環(huán)素、慶大霉素、氟甲砜霉素和增效磺胺類藥物敏感,但大多菌株對紅霉素、氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抵抗力.

　　(三)免疫鑒于1周齡前的仔豬鼻粘膜就有可能有副豬嗜血桿菌的寄生,因而僅通過早期斷奶來消除該菌是不可能取得成功.通過抗菌素來控制因感染副豬嗜血桿菌而引起的疾病,結(jié)果往往得不償失.將副豬嗜血桿菌徹底消除出豬群也許并不可取,因為在這之后混養(yǎng)于無病原菌豬群的帶菌豬和生產(chǎn)后期潛伏有副嗜血桿菌的豬,可能引起全群豬發(fā)病,造成毀滅性的經(jīng)濟損失.向一個豬群中引人健康狀況不同的新豬群時,應(yīng)當(dāng)隔離飼養(yǎng)并維持一個足夠長的適應(yīng)期,以使那些沒有免疫接種但有感染條件飼養(yǎng)的豬群建立起保護性免疫力. 母代的免疫力和天然的免疫力是控制疾病過程的關(guān)鍵因素.預(yù)先讓豬接觸無致病力的副豬嗜血桿菌株,以培養(yǎng)其對后來的有毒菌株刺激的抵抗力.母豬接種后可對4周齡以內(nèi)的仔豬產(chǎn)生保護性免疫力,這時再用含相同血清型的滅活苗激發(fā)仔豬的免疫力,對斷奶仔豬產(chǎn)生保護性免疫力.由于該菌的敗血癥特性,抗體很可能是保護性免疫的主要困素. 疫苗的使用是預(yù)防副豬嗜血桿菌造成損失的最為有效的方法之一,疫苗在西班牙、澳大利亞、加拿大和美國應(yīng)用極為廣泛.在我國,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病毒室已成功研制出副豬嗜血桿菌多價油乳劑滅活苗.其接種方法為:母豬產(chǎn)前4-6周、仔豬l周齡、3-4周齡各接種一次,公豬一年兩次免疫接種即可.

　　大量報道指出,通過商業(yè)疫苗接種或使用特異性滅活菌苗(自家組織苗),可以成功地控制該病的發(fā)生,但也有少數(shù)使用滅活菌苗預(yù)防失敗的事例,這可能是由于病程中出現(xiàn)的菌株血清型不同而缺乏交叉保護.已有的資料表明,副豬嗜血桿菌具有明顯的地方性特征,疫苗免疫在不同的血清型之間所引起的交叉保護率很低.因此,在一個特定的地區(qū),清楚地知道最流行的血清型對于有效控制該病至關(guān)重要. 雖然交叉保護是對商用滅活菌苗的基本要求,但是豬特異性滅活苗可能因為豬群中存在不止一種菌株或血清型而缺乏功效,也可能因為后來豬群中引入新的菌株而失去功效.現(xiàn)已證明,有毒力的菌株可能不受相同血清型的無毒菌株激發(fā)保護而致病,甚至同源菌株的激發(fā)也無濟于事,這表明保護性抗原與毒性因子或型特異性抗原并不一致. 如同對異源性血清型的交叉保護一樣,相同血清型的不同菌株可激發(fā)免疫力,這種交叉保護的功效已通過含血清型4和5型的副豬嗜血桿菌苗得到證實.研究表明,代表幾種血清型和非血清型的菌株都有毒力,由于菌株致病力的差異,以及當(dāng)前對保護性抗原和毒性因子缺乏深刻的認(rèn)識,還不可能有一種滅活菌苗同時對豬有的致病株產(chǎn)生交叉保護力.副豬嗜血桿菌的控制方案可能包括免疫疫苗接種和抗菌素處理,但也應(yīng)當(dāng)加強飼養(yǎng)管理,以減少或消除其它呼吸道病原,如加強通風(fēng)、降低濕度、減少豬群流動、杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況等.

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